安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀測(cè)定人血漿中 15 種膽汁酸含量的方法研究
摘要
本研究建立了一種基于安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）測(cè)定人血漿中 15 種膽汁酸含量的分析方法，旨在為臨床相關(guān)疾病的診斷、治療及病理機(jī)制研究提供準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)技術(shù)支撐。通過優(yōu)化樣品前處理方法、色譜分離條件及質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)，對(duì)方法的專屬性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證。結(jié)果表明，15 種膽汁酸在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2 均大于 0.998），日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于 8%，準(zhǔn)確度在 85%-115% 之間，基質(zhì)效應(yīng)影響較小，且樣品在不同儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定性良好。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可滿足人血漿中 15 種膽汁酸同時(shí)定量檢測(cè)的需求，為臨床實(shí)驗(yàn)室開展膽汁酸相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目及科研工作提供了有效的技術(shù)手段。
安益譜TQ9100三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀
目前，用于測(cè)定生物樣本中膽汁酸的分析方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）及液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）等 [5]。HPLC 法雖操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但靈敏度較低，且難以實(shí)現(xiàn)多種膽汁酸的同時(shí)分離與定量；GC-MS 法需要對(duì)膽汁酸進(jìn)行衍生化處理，操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，且衍生化過程可能引入誤差；而 LC-MS/MS 法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分辨率高、分析速度快及可實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已成為生物樣本中膽汁酸定量分析的首選方法 [6-7]。
安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀是一款性能優(yōu)異的分析儀器，具備高靈敏度、高穩(wěn)定性及良好的重現(xiàn)性，在生物樣本分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究旨在利用該儀器，建立一種可同時(shí)測(cè)定人血漿中 15 種膽汁酸（包括游離型膽汁酸：膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸；結(jié)合型膽汁酸：甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、牛磺膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸、?；鞘懰帷⑴；切苊撗跄懰幔┖康?LC-MS/MS 方法，并對(duì)方法進(jìn)行全面驗(yàn)證，以期為臨床及科研工作提供可靠的檢測(cè)方法。
實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
2.1.1 儀器
安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源（ESI））
2.1.2 試劑與耗材
15 種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品（膽酸（CA）、鵝脫氧膽酸（CDCA）、脫氧膽酸（DCA）、石膽酸（LCA）、熊脫氧膽酸（UDCA）、甘氨膽酸（GCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（GCDCA）、甘氨脫氧膽酸（GDCA）、甘氨石膽酸（GLCA）、甘氨熊脫氧膽酸（GUDCA）、?；悄懰幔═CA）、?；蛆Z脫氧膽酸（TCDCA）、牛磺脫氧膽酸（TDCA）、?；鞘懰幔═LCA）、牛磺熊脫氧膽酸（TUDCA），純度均≥98%，美國(guó) Sigma-Aldrich 公司）；氘代內(nèi)標(biāo)（膽酸 - d4（CA-d4）、甘氨膽酸 - d4（GCA-d4）、?；悄懰?- d4（TCA-d4），純度均≥98%，美國(guó) C/D/N Isotopes 公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）； ammonium acetate（分析純，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（18.2 MΩ?cm）；固相萃取柱（Oasis HLB，30 mg/1 mL，美國(guó) Waters 公司）；人血漿樣本（來源于健康志愿者，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者知情同意）。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別精密稱取 15 種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容，配制濃度為 1.0 mg/mL 的單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于 - 20℃冰箱中避光保存。使用時(shí)，取各單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度為 10.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。再根據(jù)需要，用空白血漿（經(jīng)處理后不含待測(cè)膽汁酸的人血漿）稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制得到一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
精密稱取氘代內(nèi)標(biāo)（CA-d4、GCA-d4、TCA-d4）適量，用甲醇溶解并定容，配制濃度為 1.0 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于 - 20℃冰箱中避光保存。使用時(shí)，用甲醇稀釋內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，得到濃度為 1.0 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作溶液。
2.2.2 樣品前處理
取人血漿樣本 50 μL，置于 1.5 mL 離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液 10 μL，渦旋混勻 1 min；隨后加入甲醇 150 μL，渦旋振蕩 2 min，以沉淀蛋白質(zhì)；將離心管置于高速離心機(jī)中，在 4℃、12000 r/min 條件下離心 10 min，吸取上清液置于另一干凈的離心管中；向沉淀中再次加入甲醇 100 μL，渦旋振蕩 1 min，4℃、12000 r/min 離心 8 min，合并兩次上清液；將合并后的上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（預(yù)先用 500 μL 甲醇活化，再用 500 μL 超純水平衡）中，依次用 500 μL 超純水和 500 μL 5% 甲醇水溶液洗脫雜質(zhì)，最后用 500 μL 90% 甲醇水溶液洗脫待測(cè)組分，收集洗脫液；將洗脫液置于氮吹儀中，在 40℃條件下氮?dú)獯蹈?；加入流?dòng)相（甲醇 - 0.1% 甲酸水溶液，體積比為 60:40）100 μL 復(fù)溶，渦旋振蕩 1 min，4℃、12000 r/min 離心 5 min，取上清液，待測(cè)。
2.2.3 色譜條件
色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A 相為 0.1% 甲酸水溶液，B 相為甲醇；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序如下：0-2 min，B 相 30%；2-8 min，B 相 30%-80%；8-12 min，B 相 80%-95%；12-15 min，B 相 95%；15-15.1 min，B 相 95%-30%；15.1-20 min，B 相 30%；流速：0.3 mL/min。
2.2.4 質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴霧電壓：-4500 V；離子源溫度：500℃；霧化氣壓力（GS1）：50 psi；輔助氣壓力（GS2）：50 psi；氣簾氣壓力（CUR）：35 psi；碰撞氣壓力（CAD）：Medium。15 種膽汁酸及內(nèi)標(biāo)的 MRM 參數(shù)（包括母離子、子離子、碰撞能量、去簇電壓等）通過直接注入標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行優(yōu)化確定，具體參數(shù)見表 1（此處省略表格，實(shí)際論文中需詳細(xì)列出每種物質(zhì)的參數(shù)）。
2.3 方法驗(yàn)證
按照《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》（中國(guó)藥典 2020 年版四部通則 9012）及相關(guān)國(guó)際規(guī)范，對(duì)建立的方法進(jìn)行專屬性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等方面的驗(yàn)證。
2.3.1 專屬性
取空白血漿、空白血漿添加 15 種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)、健康人血漿樣本，按照上述樣品前處理方法處理后，進(jìn)行 LC-MS/MS 分析，記錄色譜圖，考察空白血漿中的雜質(zhì)是否對(duì)待測(cè)膽汁酸及內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。
2.3.2 線性范圍
取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，以各膽汁酸的濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)為 1/x2）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），確定各膽汁酸的線性范圍。
2.3.3 精密度
選取低、中、高三個(gè)濃度水平（分別為線性范圍的低限附近、中間濃度、高限附近）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度水平平行制備 6 份樣品，按照上述方法進(jìn)行分析，計(jì)算日內(nèi)精密度（RSD）；連續(xù) 3 天，每天對(duì)每個(gè)濃度水平平行制備 6 份樣品進(jìn)行分析，計(jì)算日間精密度（RSD）。
2.3.4 準(zhǔn)確度
采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證。選取空白血漿，分別添加低、中、高三個(gè)濃度水平的 15 種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度水平平行制備 3 份樣品，按照上述樣品前處理方法處理后進(jìn)行 LC-MS/MS 分析，計(jì)算回收率，回收率在 85%-115% 之間視為準(zhǔn)確度合格。
2.3.5 基質(zhì)效應(yīng)
分別取 6 份不同來源的空白血漿，按照上述樣品前處理方法處理后，加入一定濃度的 15 種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液；同時(shí)，用流動(dòng)相配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（不含基質(zhì)）。將兩種溶液按照上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中各膽汁酸峰面積與流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)峰面積的比值，若比值在 80%-120% 之間，表明基質(zhì)效應(yīng)影響較小。
2.3.6 穩(wěn)定性
選取低、中、高三個(gè)濃度水平的加標(biāo)血漿樣品，分別考察其在室溫條件下放置 4 h（室溫穩(wěn)定性）、4℃冰箱中放置 24 h（冷藏穩(wěn)定性）、-20℃冰箱中冷凍保存 30 天（冷凍穩(wěn)定性）及經(jīng)過 3 次凍融循環(huán)（凍融穩(wěn)定性）后的穩(wěn)定性。每個(gè)條件下平行制備 3 份樣品，按照上述方法進(jìn)行分析，計(jì)算各膽汁酸的測(cè)定濃度與理論濃度的比值，若比值在 85%-115% 之間，表明樣品在該條件下穩(wěn)定性良好。
