基于 ANYEEP TQ9100 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的人血清脂溶性維生素檢測(cè)方法研究
技術(shù)博客 | 2025-09-02 | 閱讀
一、引言：脂溶性維生素檢測(cè)的臨床意義與技術(shù)需求
脂溶性維生素（維生素 A、D、E、K）是人體必需的微量營養(yǎng)素，雖無法自主合成，卻在生理代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用：維生素 A（VA）維持視覺功能與上皮組織完整性，缺乏易致夜盲癥；25 - 羥基維生素 D2（25OHVD2）、25 - 羥基維生素 D3（25OHVD3）調(diào)控鈣磷代謝，不足會(huì)引發(fā)骨骼發(fā)育異常；維生素 E（VE）作為抗氧化劑保護(hù)細(xì)胞膜，缺乏可能導(dǎo)致生育功能異常；維生素 K1（VK1）參與凝血因子合成，缺乏易造成凝血功能障礙。
此類維生素缺乏多呈 “亞臨床漸進(jìn)性”，早期無明顯癥狀，長(zhǎng)期不足才顯現(xiàn)特征性病癥，因此臨床精準(zhǔn)檢測(cè)至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法（如高效液相色譜法 HPLC）存在靈敏度低、無法同時(shí)區(qū)分同系物（如 25OHVD2 與 25OHVD3）等局限，而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）憑借高特異性與高靈敏度，成為脂溶性維生素檢測(cè)的優(yōu)選技術(shù)。
ANYEEP TQ9100 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)創(chuàng)新性支持電噴霧離子化源（ESI）與大氣壓化學(xué)電離源（APCI）雙模式，無需切換離子源或變更色譜條件即可完成 5 種脂溶性維生素的同步檢測(cè)，為臨床血清樣本分析提供高效、便捷的技術(shù)方案。
安益譜TQ9100三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀
- 主儀器：ANYEEP TQ9100 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（配備 ESI/APCI 雙離子源、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱）；
- 色譜柱：Phenomenex Kinetex F5 Column（3.0mm×50mm，2.6μm），該柱基于五氟苯基固定相，對(duì)脂溶性化合物具有優(yōu)異的保留與分離性能，可有效區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的維生素同系物；
- 輔助設(shè)備：渦旋振蕩器（轉(zhuǎn)速 0~3000rpm）、高速離心機(jī)（低溫可控 4℃，最高轉(zhuǎn)速 15000rpm）、氮吹儀（控溫范圍 30~60℃）、微孔板震蕩儀（轉(zhuǎn)速 0~3000rpm）。
- 提取溶劑：異丙醇（色譜純），用于沉淀血清中的蛋白質(zhì)，釋放脂溶性維生素；
- 流動(dòng)相：流動(dòng)相 A 為含 0.1% 甲酸的超純水，流動(dòng)相 B 為含 0.1% 甲酸的甲醇（均為質(zhì)譜級(jí)），甲酸的添加可提升正離子模式下的離子化效率；
- 復(fù)溶液：50% 乙腈（色譜純），平衡樣品基質(zhì)與流動(dòng)相，減少基質(zhì)效應(yīng)；
- 標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)：VA、25OHVD2、25OHVD3、VE、VK1 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）；VA-d6、25OHVD2-d3、25OHVD3-d6、VE-d6、VK1-d4 內(nèi)標(biāo)物（純度≥99%），用于校正樣品前處理損失與儀器響應(yīng)波動(dòng)。
血清中含有大量蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，需通過 “沉淀 - 提取 - 濃縮 - 復(fù)溶” 四步處理去除基質(zhì)干擾，具體步驟如下：
- 取樣與加標(biāo)：取 200μL 待測(cè)血清樣本于 1.5mL EP 管中，加入 20μL 內(nèi)標(biāo)溶液（確保內(nèi)標(biāo)在樣本中的終濃度與標(biāo)準(zhǔn)品一致），再加入 400μL 異丙醇；
- 蛋白沉淀與離心：2500rpm 渦旋混勻 5min，使異丙醇充分沉淀蛋白質(zhì)；4℃條件下 14000rpm 離心 5min，分離上清液（含目標(biāo)維生素）與蛋白沉淀；
- 濃縮干燥：取 500μL 上清液轉(zhuǎn)移至 96 孔板中，40℃氮吹至干（避免高溫導(dǎo)致維生素降解）；
- 復(fù)溶與進(jìn)樣：加入 100μL 50% 乙腈復(fù)溶液，2000rpm 震搖 2min 使殘留物充分溶解；4000rpm 離心 5min 去除微小雜質(zhì)，取 10~20μL 上清液進(jìn)樣分析。
該流程無需固相萃取等復(fù)雜步驟，單樣本處理時(shí)間僅需 30min，兼顧效率與純度，可滿足臨床批量樣本檢測(cè)需求。
針對(duì) ESI 與 APCI 源的離子化特性，設(shè)計(jì)差異化梯度洗脫程序，確保 5 種維生素在兩種離子源模式下均能實(shí)現(xiàn)良好分離，具體參數(shù)見表 1。
表 1 梯度洗脫條件
注：A 相為水（含 0.1% 甲酸），B 相為甲醇（含 0.1% 甲酸）；柱溫恒定 40℃，避免溫度波動(dòng)影響保留時(shí)間穩(wěn)定性。
采用正離子模式（ESI+、APCI+），通過優(yōu)化離子源溫度、噴霧電壓、碰撞能量等參數(shù)，確定每種維生素的特征離子對(duì)（1 對(duì)定量離子對(duì) + 1 對(duì)定性離子對(duì)），確保檢測(cè)特異性與靈敏度，核心參數(shù)見表 2。
表 2 脂溶性維生素及內(nèi)標(biāo) MRM 離子對(duì)參數(shù)
注：DP 為去簇電壓，CE 為碰撞能量；ESI 源霧化氣 50psi、輔助加熱氣 55psi，APCI 源霧化氣 20psi、無輔助加熱氣；氣簾氣統(tǒng)一為 10psi，EP 7.5V，CXP 2V。
通過線性范圍、相關(guān)系數(shù)、精密度（RSD%）、準(zhǔn)確度（回收率 %）四項(xiàng)核心指標(biāo)，驗(yàn)證方法的可靠性，結(jié)果見表 3。
表 3 脂溶性維生素保留時(shí)間、線性范圍、回歸方程、精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果
注：低濃度為線性范圍下限的 3 倍，高濃度為線性范圍上限的 70%；RSD%≤10%（除 ESI 源 VK1 低濃度 17.9%，可能因 VK1 在低濃度下受基質(zhì)干擾略高），回收率 90.5%-105.6%，符合臨床檢測(cè)要求。
- 分離效果：各維生素色譜峰形對(duì)稱，無明顯拖尾或重疊，VA、25OHVD2、25OHVD3 保留時(shí)間集中在 2.3-2.9min，VE、VK1 集中在 4.1-4.5min，分離度均≥1.5；
- 信號(hào)響應(yīng)：目標(biāo)離子峰信號(hào)強(qiáng)，背景噪聲低，如 25OHVD2（0.11ng/mL）、25OHVD3（12ng/mL）、VE（8.1μg/mL）等均能準(zhǔn)確檢出，且內(nèi)標(biāo)峰與目標(biāo)峰無干擾；
- 雙源一致性：同一血清樣本在 ESI 與 APCI 源下的檢測(cè)結(jié)果偏差≤8%，說明兩種離子源均可穩(wěn)定用于檢測(cè)，無需因樣本差異切換離子源，提升操作便捷性。
- 雙離子源兼容：無需更換離子源或調(diào)整色譜條件，即可實(shí)現(xiàn)兩種離子化模式切換，適配不同極性的脂溶性維生素（如極性略高的 25OHVD2/25OHVD3 更適合 ESI，非極性的 VK1 更適合 APCI）；
- 高靈敏度與特異性：MRM 模式結(jié)合內(nèi)標(biāo)法，最低檢出限（LOD）可達(dá) 0.03ng/mL（VK1），遠(yuǎn)低于臨床診斷閾值，且能有效區(qū)分 25OHVD2 與 25OHVD3（傳統(tǒng)方法易混淆）；
- 高效便捷：樣品處理流程簡(jiǎn)化，單樣本檢測(cè)時(shí)間（含前處理）≤40min，支持 96 孔板批量進(jìn)樣，日均可檢測(cè) 100 + 樣本，滿足臨床實(shí)驗(yàn)室高效需求。
